赛业生物（CyagenBiosciences）助推转基因鼠研究新潮流

——生物谷专访赛业生物CEO孙久峰先生 【生物谷-BIOONNEWS编者按】再次采访孙久峰先生，他已经从中国区市场总监荣升为赛业生物CEO。当前，赛业生物已建立起国内规模最大的基因修饰鼠商业服务平台,孙先生告诉生物谷编辑说，但这仍然无法满足国内外市场日益增长的需求。赛业生物正在建设一个5倍于目前规模的SPF级模式动物中心，计划年底就可以投入运营。这对于赛业生物而言是大事，同时也从侧面反映了，国内需求量的扩大和整个科研环境的利好！相比于上次，这次孙久峰先生在采访中对技术细节的诠释更加充分，并为我们分析了基因修饰鼠的新动向以及赛业生物的最新发展规划。 生物谷：去年9月份我们曾经就转基因小鼠技术采访过赛业生物，当时也是您为我们做的解答，我们了解到赛业生物的转基因小鼠技术服务在当时就已经具备了相当的影响力。但业内人士可能都知道，赛业生物在干细胞科研领域有着更久远的经营历史和知名度，同样作为生命科学领域的前沿技术，请问二者有什么必然联系吗？ 孙久峰：没错，作为赛业生物（Caygen Biosciences）在中国区创办的第一家子公司即赛业（广州）生物科技确实是将我们所擅长的标准化干细胞科研试剂和服务作为起点，早几年就已经建立起了全球品种最齐全的科研干细胞库，并成为国际广为认可的科研干细胞供应商。但作为赛业生物的整个科学技术团队，除了干细胞以外，在分子生物学、转基因动物等前沿领域也有着非常牢固的技术基础和丰富的研究经验，世界上首例\"异种嵌合体\"动物就是赛业生物的专家团队构建成功的，该成果至今在国际上仍然享有盛誉（文章标题为：Extensive contribution of embryonic stem cells to the development of anevolutionarily divergent host）。我们随后又建立了包罗万象的分子生物学平台、转基因动物平台，目前，我们的细胞生物学、分子生物学及转基因动物产品和技术服务已经遍及世界各大生命科学实验室，得到了国内外科研工作者的广泛认可。 干细胞与转基因动物作为研究生命现象最理想的体外和体内媒介，其重要性早已为业内人士所共知，在此就不再赘述了。就其技术本身，二者也有着一定的联系，2007年的诺贝尔医学奖授予了三位从事\"利用胚胎干细胞把特定基因改性引入实验鼠的原理\"研究的科学家，充分揭示了这种联系，即在某些条件下，干细胞是构建转基因动物的重要手段。 生物谷：最近几个月，我们也关注到，赛业生物（Cyagen Biosciences）越来越多的出现在Nature、Science、PNAS、StemCells等高端杂志上，而且是跟转基因小鼠技术有关，能向我们介绍一下具体情况吗？ 孙久峰：事实上，目前我们每年为客户制作数百个种系的基因修饰小鼠，规模已经在国内遥遥领先，而且每年都在翻番，我们的服务对象遍及世界各地，接下来，引用\"Cyagen Biosciences\"的高端刊物会越来越多。 记得去年我在接受生物谷采访时就曾经提到过，我们发现的一个有趣的现象--我们客户中最大的一部分人来自于基因调控研究领域，他们都在密切关注一个共同的研究方向，即那些被经典遗传学认为是\"垃圾\"的非编码区序列。当时，我们出于要对客户信息的保密，无法透露更多的信息，而现在很多客户的文章都已经发表在前面提到过的那些高端杂志上，我们可以就此展开一些讨论。 说得更具体一点就是，人类和小鼠基因组被破译后，研究者发现这两个基因组中的近3万条基因只占基因组全序列的百分之几，而其余的90%以上都是\"暗物质\"即非编码区，而这些\"暗物质\"在生物遗传过程中起着非常重要的基因调控作用，这引起了学术界目光敏锐的学者们巨大的研究兴趣。 赛业生物在过去几年协助欧美多所大学和研究机构进行了小鼠基因组非编码区组织特异性调控序列的系统化查找，一个典型的办法就是将利用生物信息学手段找出的多物种间非编码区的保守序列和标记基因一起转入小鼠，并研究他们在小鼠胚胎发育过程中对组织特异性表达所起的作用。目前这些研究正在产生越来越多的成果，也正在改变着我们对基因组\"暗物质\"的认识。例如今年3月10号的Nature中发表的一项由斯坦福大学牵头，多所大学参加的研究（文章标题为：Human-specific loss of regulatory DNA and the evolution of human-specifictraits）就引用了赛业生物（CyagenBiosciences）的转基因小鼠服务。我们为这项研究制作了近百种转基因小鼠，使用了多项特有技术，其中有些是为这项研究专门设计的技术。这项研究得出了非常有趣的结论：人类在进化过程中一些人类特征的获得是通过非编码调控序列的丢失完成的。 生物谷：据我们了解，利用小鼠做基因功能研究的历史已经有30年了，您之前提到的获2007年诺贝尔医学奖的基因敲入小鼠（Knock-inmouse）技术也已经存在了20多年。这么多年过去了，DNA的原核注射和重组ES的囊胚注射似乎仍然是转基因模式动物研究领域中经久不衰的两大核心技术，是什么使得这两大技术经受住了时间的考验呢？ 孙久峰：这两大技术确实经久不衰，在过去二十多年间为我们研究基因功能、寻找疾病机理以及解释发育现象等立下了汗马功劳，而且必将发挥更大的作用。原核期的受精卵是最早期的胚胎，这个时期将外源DNA，注入胚胎，即我们所说的原核显微注射，在精子和卵子的细胞核融合之前的短暂期间，外源基因非常容易整合到胚胎的基因组，从而产生携带外源基因的转基因小鼠。囊胚期的胚胎有几十到上百个全能且不分彼此的胚胎干细胞也就是ES细胞，可以在之后的发育过程中分化为三个胚层的所有组织特异性细胞，在这个阶段将经过基因改造的ES细胞注入囊胚，内源和外源的ES将在同一环境中共同发育，形成嵌合体，并通过生殖遗传得到基因改造的小鼠。这两个非常有趣的生命现象被人们利用，分别形成了DNA的原核注射和重组ES的囊胚注射两个非常有用的技术体系，并在这两个体系上发展出了很多不同的特有技术。有价值的技术是不容易被取代、经得起时间考验的技术，这就是最好的例证。 生物谷：能不能介绍一下基因修饰鼠的最新动向？ 孙久峰：前面讲过DNA原核注射和ES囊胚注射仍然是两个主流技术体系，但这两个体系都有各自的局限，前一个体系相对简单，但很大的局限是DNA随机插入，拷贝数和插入位点无法通过技术的手段加以控制，这样一来外源DNA的插入是否会打乱正常基因的表达，外源DNA是否能保持完整，表达强度如何等都很难控制。后一个体系则过于繁琐，一般来讲，构建打靶载体已经是一项很费时费力的工作，之后ES还需要利用打靶载体进行同源重组并经过筛选和鉴定才能进行囊胚注射，得到的嵌合体还需要再经过生殖遗传得到外源ES的遗传个体，整个过程需要一年到一年半的时间；对于研究者来说，通过这个体系得到的动物模型对研究是最有价值的，但时间也是最宝贵的财富，这无疑是一件让人感到骑虎难下的事情。近来出现的分子生物学最新手段为解决这些局限带来了突破性的进展，具体说来就是基因组靶向修饰技术在基因修饰鼠方面的应用。 生物谷：能不能具体介绍一下你所说的基因组靶向修饰技术？ 孙久峰：锌指核酸酶（Zinc-fingernucleases，ZFN）技术的出现促使基因组靶向修饰技术向前迈进了一大步。锌指蛋白源自转录调控因子家族（transcriptionfactorfamily），在真核生物中从酵母到人类都广泛存在，ZFN由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA识别域是由一系列锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性，很适合用于人工设计。然而目前对于许多研究者而言，设计出特异性靶向基因组目的序列的锌指核酸酶仍然是一个巨大的技术挑战。 今年二月，来自SangamoBioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALEs（transcriptionactivator-likeeffector，TALE）技术进行了基因组靶向修饰相关研究，两篇论文同时发表在Nature Biotechnology。与ZFN不同的是TALEs源于细菌，与ZFN相似的是，TALEs也是由特异性识别DNA的串联\"蛋白模块\"组成。每个\"蛋白模块\"包含靶向识别的关键位点，然而不同于每个锌指蛋白识别特异性的三联体碱基，TALEs上的每个位点仅识别一个碱基，因此特异性更高，更利于人工设计。 目前一个常用的质粒构建方法就是人工构建含attP和attB位点的质粒，在整合酶的作用下attP和attB处发生交叉重组，产生两个较小的环状DNA，从而实现基因片段的整合。现在这项技术也被用于外源基因在小鼠基因组的定点插入。首先构建带attP位点的工具鼠，再通过将带attB位点的目的基因片段和可以表达整合酶的mRNA注射到小鼠原核中去，可以以很高比例将目的基因插入attP位点。 这些分子生物学上的技术应用到基因修饰鼠的制作可以提高效率，减少基因插入的随机性。ZFN技术经过多年已趋于完善，最近甚至已经被应用于基因修饰大鼠的制作。但Sigma-Aldrich对该技术的垄断制约了其推广。TALEs技术应该在基因修饰鼠的应用上很有前景。attP/attB技术对于高效的基因定点插入十分有用。 生物谷：您刚才提到转基因修饰大鼠，这和小鼠比较有什么优势？ 孙久峰：与基因修饰小鼠相比，基因修饰大鼠的制作难度和费用大得多，成功率低得多，周期也长得多。一些技术瓶颈制约了其应用，如大鼠的超排卵较比小鼠难得多，不易获得大量用于原核注射的受精卵。大鼠ES的建系也是学术界刚刚才解决的问题。但大鼠作为模式动物的优势与小鼠相比也是很明显的，在诸多方面，它跟人的遗传背景距离更近，得到的研究数据更有意义；另外，由于大鼠体积比小鼠大得多，更易于解剖操作和体内观察。因此，如果能解决主要的技术瓶颈，其应用就有机会推广。赛业生物在基因修饰大鼠方面也已经做好了技术储备，只要有市场需求我们都可以快速推出相应的服务。 生物谷：能透露一下赛业生物在基因修饰鼠方面的下一步发展规划吗? 孙久峰:从业务范围看，赛业生物目前能提供的基因修饰鼠服务包括DNA原核显微注射，ES囊胚显微注射，基因打靶小鼠构建（其中包括基因敲入/敲除、基因定点整合小鼠等），及其它相关技术，基本涵盖了国际上主流的研究方向。我们目前正在建立前面提及的各新技术平台，其中包括高效的基因敲除大鼠技术服务平台，希望能以更实惠的价格为国内科研工作者和药物研发机构提供与国际同步的高端技术，为国内的基础研究和药物研发尽绵薄之力。 从业务规模看，赛业生物虽然已经成为目前国内服务效率最高、规模最大的基因修饰鼠商业服务平台，但仍然无法满足国内外市场日益增长的需求。因此，我们正在建设一个五倍于目前规模的SPF级模式动物中心，计划年底就可以投入运营，达到每年构建数千个基因修饰鼠种系的服务能力。 我们的座右铭是\"We help you discover life!\"；我们的目标是在技术和规模方面都达到世界领先水平，成为全球科研工作者首选的基因修饰鼠技术平台和科研试剂、服务供应商之一，从当前我们的发展趋势和市场反馈来看，这一目标并非遥不可及。 关于赛业生物（Cyagen Biosciences） 赛业生物科技有限公司是美国Cyagen Biosciences Inc.旗下的中国区子公司，是目前国内唯一一家面向国内和国际同时提供干细胞、原代细胞、载体构建、病毒包装、分子检测及转基因模式动物产品和技术服务的商业化生物科技公司。 目前公司已成为全球最大的科研干细胞供应商，拥有全球品种最齐全的科研干细胞库，拥有超过300种的细胞生物学系列产品及数十个方向的细胞、分子技术服务。同时拥有国内服务能力最强的转基因模式动物技术服务平台，该平台已为国内外客户构建了数百个转基因小鼠系。Cyagen的客户遍及欧、美、澳、日、中等世界各大知名实验室。

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